الکتروفورز (electrophoresis) - بخش دوم
ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز (isoelectric focusing electrophoresis)
ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز ترکیبهای امفوتریک (amphoteric) مانند پروتیین ها را با توان جداسازی بالا در یک محیطی با شیب pH پایدار ، جدا میکند.پروتیین تا نقطه ای روی ژل مهاجرت میکند و در آن نقطه متمرکز (focused) میشود که pH ژل در آن نقطه با نقطه ایزوالکتریک (pH ی که بارهای مثبت با بارهای منفی روی مولکول باهم برابرند) پروتیین برابر است.در این نقطه بار پروتیین صفر است و مهاجرت آن متوقف میشود. شکل 12-4 روش انجام و شرایط الکتروفورزی را پیش و پس از برقراری جریان نشان میدهد.
بخاطر اینکه ناحیه مربوط به pH مورد نظر بسیار باریک (narrow) است ناحیه های پروتیین ،بسیار شفاف (sharp) هستند. با انتشار معمولی (ordinary diffusion) نیز به وسیله باردار شدن مولکول پروتیین مقابله میشود، همینکه پروتیین از نقطه ایزوالکتریک خود حرکت میکند دارای بار شده و دوباره به وسیله نیروهای الکتروفورزی به نقطه ایزوالکتریک خود باز میگردد( شکل 12-5( .پروتیین هایی که در نقطه ایزوالکتریک خود تنها به اندازه 0.02 واحد pH فرق دارند با ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز جدا شده اند.
شیب pH با امفولیت های حامل (carrier ampholytes) ، گروهی از پلی امینو کربوکسیلیک اسیدهای امفوتریک (polyaminocarboxylic acids amphoteric) ساخته میشوند که تفاوت بسیار کمی در ارزش pKa خود دارند و وزن مولکولی آنها بین 300 تا 1000 است.مخلوطی از 50 تا 100 ترکیب مختلف به محیط اضافه میشود و یک شیب pH طبیعی به هنگام رسیدن هر امفولیت به نقطه ایزوالکتریک خود طی الکتروفورز ، ایجاد میشود.این ها ناحیه های بافری بسیار باریک و بسیار پایدار ولی با تفاوت بسیار کم در pH ، ایجاد میکنند که از میان آنها پروتیین ها به آهستگی مهاجرت کرده و در نقطه ایزوالکتریک خودشان می ایستند.
همانطور که شکل 12-4 نشان میدهد آند با یک محلول اسیدی رقیق و کاتد با یک محلول قلیایی رقیق در بر گرفته شده است. بعد از تمرکز (focusing) ،امفولیت های حامل و پروتیین های بیشتر منفی در انتهای آند و آنهایی که بیشتر بار مثبت دارند نزدیک انتهای کاتدی ماتریکس الکتروفورزی یافت میشوند.دیگر امفولیت های حامل و پروتیین ها در نقطه های میانه مطابق با نقطه ایزوالکتریک خودشان تمرکز می یابند.از آنجایی که امفولیتهای حامل بطور کلی در غلظتهای بسیار بالا استفاده میشوند یک منبع تغذیه ولتاژ بالا (تا 2000 V) لازم است ( توان نزدیک به 2-50 W است ، بسته به شرایط آزمایش ). در نتیجه ماتریکس الکتروفورزی باید سرد شود. نوع اصلاح شده این تکنیک به نام (IPG-IEF) که در آن شیب pH بی حرکت شده (immobilized pH gradient = IPG) پیش از اینکه نمونه بکار برده شود ایجاد میشود. گزارش شده که این تکنیک اصلاح شده توان جداسازی و بازتولید (reproduceability) را بهبود بخشیده است.
PAGE-IEF به این خاطر که فاقد پدیده الکترواندوسموز است در کارهای انالیزی بسیار استفاده شده است.ژل پلی اکریلامید باید دارای روزنه هایی به اندازه کافی بزرگ باشد اما با این حال از مهاجرت پروتیین ها در اثر غربال مولکولی نباید جلوگیری شود. در عمل از مهاجرت نکردن شماری از پروتیین ها مانند IgM نمیتوان دور بود.AGE-IEF برتری هایی دارد از آنجمله اینکه شرایط آزمایش ساده است و اینکه بزرگی اندازه روزنه ها جدانشدن پروتیین ها بر پایه اندازه مولکولی را نامحتمل میکند.ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز در جداسازی ایزوانزیم های الکالین فسفاتاز و در برنامه های غربالگری نوزادان جهت بررسی واریانت های هموگلوبین بطور گسترده بکار رفته است. تکنیکهای off-gel در محلول آزاد و با نمونه دارای امفولیت ها انجام میشود ، این نمونه در هر یک از سری چاهک (well) های خطی که با غشاهای نیمه تراوا (semipermeable) از هم جدا شده اند و در تماس با یک نوار شیب pH هستند ، بارگذاری میشوند و سپس الکتروفورز انجام میشود. الکتروفورز پروتیین های نمونه را در چاهکهای مختلف بسته به ارزش نقطه ایزوالکتریک آنها جدا میکند. بخش های جدا شده در گام فوینگ دوم مشابه بیشتر جدا میشود و یا اینکه مستقیم ، برای جداسازی بیشتر به روش الکتروفورز دو بعدی (2D electrophoresis) یا روش کروماتوگرافی مایع-اسپکترومتری جرمی (liquid chromatography-mass spectrometry = LC-MS/MS) برداشت میشوند.این تکنیک در بررسی پروتئوم (proteome) انسان کاربرد دارد.
ایزوتاکوفورز (isotachophoresis)
ایزوتاکوفورز همه مواد یونی کوچکتر را در ناحیه هایی نزدیک به هم بدون همپوشانی ،همه آنهایی را که با سرعت یکسان حرکت میکنند ، جدا میکند.در این تکنیک الکترولیتهای پس زمینه (buffer) با نمونه مخلوط نمی شود و بنابراین همه جریان با یونهای باردار نمونه انجام میشود.بخش کوچکی از نمونه در یک کاپیلاری میان یک محلول الکترولیت پیشرو (leading) که دارای یون های با سرعت مهاجرت بالا نسبت به هر چیزی درون نمونه است و یک محلول دنباله (trailing) که دارای یون هایی با سرعت مهاجرت پایین تر نسبت به آنچه در نمونه است ، جاگذاری میشود.هنگامی که اجزای دارای سرعت بالا بطور کامل از اجزا با سرعت پایین جدا میشود یک ناحیه تهی از بار ایجاد میشود و مقاومت را افزایش میدهد و در نتیجه ولتاژ در آن ناحیه نیز بالا میرود.ولتاژ افزایش یافته سبب میشود که اجزای با سرعت آهسته سریعتر مهاجرت کنند و شکاف به وجود آمده را بپوشانند ، به این وسیله سبب غلیظ شدن آن و افزایش هدایت در ناحیه آن میشود تا اینکه به ناحیه یون های سریعتر برسد. در نهایت ، همه یون ها با سرعت سریعترین یون به سمت ناحیه (zone)هایی مهاجرت میکنند که این ناحیه (zone)ها متناسب با غلظت ابتدایی خود در اندازه فرق دارند.اندازه ناحیه به وسیله اندازه گیری جذب فرابنفش ، اختلاف دما یا هدایت طی گذر نمونه از یک آشکارساز تعیین میشود.کاربردهای این تکنیک در جداسازی همه آنیون ها و کاتیون ها ، اسیدهای آلی و اسیدهای امینه و پپتیدها ، نوکلئوتیدها ،نوکلئوزیدها و پروتیین ها کاربرد دارد.
الکتروفورز با میدان پالسی (pulsed-field electrophoresis)
در الکتروفورز با میدان پالسی ، توان (power) بطور دوره ای (alternately) برای جفت الکترودهای مختلف یا ردیفهای الکترودی مختلف بکار برده میشود و بنابراین میدان الکتروفورزی بین دو جهت می چرخد.جهت ها از نظر فضایی از 105 تا 180 درجه می توانند فرق کنند و مولکولها باید خودشان را با جهت میدان جدید ، پیش از اینکه به مهاجرت ادامه دهند در هر دوره (cycle) هم جهت کنند. از آنجایی که زمان جهت گیری دوباره (reorientation) بستگی به وزن مولکولی دارد ، بنابراین مهاجرت خالص (net migration) تابعی از فرکانس تغییر میدان خواهد بود.این تکنیک اجازه جداسازی مولکولهای بسیار بزرگ مانند قطعه های DNA که بزرگتر از 50 kb هستند و نمی توان آنها را با ژل های اگاروز یا پلی اکریلامید دارای روزنه های کوچک جدا کرد، میدهد. قطعه های 50 – 400 kb را میتوان با زمان پالس 10-s جدا کرد در حالی که قطعه های بزرگتر تا 7 مگا باز (7 mb) و یا حتی کروموزوم دست نخورده نیازمند زمان پالس چند ساعتی برای جداسازی کامل میباشند. این تکنیک برای تعیین نوع گونه های مختلف DNA باکتری ها در بررسی های تحقیقاتی و همه گیر شناسی بکار رفته است.
الکتروفورز دو بعدی (tow-dimensional(2D) electrophoresis)
منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم
,Tietz; textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12
درباره این سایت