دانش های مرتبط با زیست فناوری(بیوتکنولوژی)



فلورومتری (Fluorometry)

 

فلورسانس به وضعیتی گفته میشود که یک مولکول نور را در یک طول موج جذب کرده و در طول موجی بلندتر گسیل میکند.اتم یا مولکولی که فلورسانس میکند فلوروفور (fluorophore) نامیده میشود. فلورومتری به اندازه گیری نور فلوروسنت گسیل شده گفته میشود.آنالیز فلورومتری یک روش تحلیلی کمی است در علوم شیمیایی و زیستی و تکنیکی بسیار حساس و درست است.

 

مفهوم های پایه (Basic Concepts)

 شکل 10-10 ارتباط بین جذب ، فلورسانس و فسفرسانس را نشان میدهد. همانطور که نشان داده شده است هر مولکول یک سری از ترازهای انرژی نزدیک به هم دارد. جذب یک کوانتوم از انرژی نوری توسط یک مولکول سبب انتقال یک الکترون از حالت پایه منفرد به یکی از  اولین ترازهای ارتعاشی اش میشود.

 

شکل 10-10

 

شمار واقعی مولکولها در حالت تحریک شده با یک منبع نوری 150 W بسیار کم و براورد شده است که 10^-13 مول به ازای یک مول فلوروفور باشد.وقتی یک مولکول در حالت تحریک شده باشد به چند روش به وضعیت انرژی ابتدایی اش باز میگردد. 1- تعادل ارتعاشی بدون تابش 2- با فلورسانس از حالت تحریک شده  3-خاموش شدن (quenching) حالت تحریک شده  4- جابجایی تقاطعی به یک تراز انرژی با حالت سه گانه  5- خاموش شدن (quenching) از تراز انرژی با حالت سه گانه  6- با فسفرسانس از تراز انرژی دارای حالت سه گانه

 

همانطور که در شکل 10-10 نشان داده شده است تعادل ارتعاشی (vibrational equilibration) پیش از فلورسانس سبب از دست رفتن مقداری از انرژی تحریکی میشود . بنابراین نور گسیل شده از فرایند فلورسانس(emission light)  طول موج بالاتری از نور تحریک کننده (excitation light) دارد. اختلاف بین بیشترین طول موج تحریک کننده و بیشترین طول موج گسیل شده از فلورسانس یک ثابتی است که به آن stokes shift میگویند.این ثابت اندازه ای از انرژی از دست رفته طی طول عمر وضعیت تحریک شده (lifetime of excited state) پیش از بازگشت به تراز انرژی پایه ای اش است ( گسیل فلورسانس ).

 

ارتباط های زمانی گسیل فلورسانس (time relationships of fluorescence emission)

زمانی که لازم است تا یک مولکول انرژی تابشی را جذب کند و به وضعیت تحریک شده برسد بطور براوردی 10^-15 ثانیه است . طول زمانی که تعادل ارتعاشی رخ میدهد تا به پایین ترین تراز انرژی تحریک شوندگی (lowest excited state) برسد براورد شده که 10^-14 تا 10^-12 ثانیه باشد. زمان لازم برای رخ دادن گسیل فلورسانس 10^-8 تا 10^-7 ثانیه است . همانطور که می بینید تاخیر زمانی قابل توجهی بین 1- جذب انرژی نوری 2-بازگشت به پایین ترین تراز انرژی تحریک شدگی 3- گسیل نور فلورسانس وجود دارد. این ارتباط های زمانی در شکل 10-11 نشان داده شده است .

 

شکل 10-11

 

در این شکل فاز 1 نمایانگر دوره زمانی بین جذب انرژی نوری و از دست رفتن انرژی بدون تابش طی بازارایی ارتعاشی به پایین ترین تراز انرژی وضعیت تحریک شده است.این دوره زمانی با فلش های رو به بالا و رو به پایین در نمودار نمایش داده شده اند.

فاز 2 گسیل و نیز زوال گسیل دو نوع فلوروفور کوتاه عمر (short lived ) و بلند عمر (long lived) را نشان میدهد.اگر گسیل فلورسانس پس از تابش یک منبع تحریک کننده مانند لامپ زنون یا لیزر ، در طول زمان اندازه گیری شود ، زوال شدت نور گسیل شده یک فرایند از درجه اول و مانند زوال رادیواکتیو است ( فاز 2 از شکل 10-11 ).زمان لازم برای رسیدن نور گسیل شده به 1/e شدت نور ابتدایی اش (e ، پایه ناپریان و برابر با 2.718 است ) میانگین طول عمر وضعیت تحریک شده یا زمان زوال فلورسانس نامیده میشود.

از تاخیر زمانی بین جذب کوانتوم های انرژی و فلورسانس در دستگاهی کردن فلورسانس استفاده میشود که فلورومتری زمانبندی شده (time resolved flourometry) نامیده میشود.

Time resolved flourometry ، بسته به اینکه گسیل فلورسانس چگونه اندازه گیری شود به دو دسته تقسیم بندی میشود.

1-        فلورومتری پالسی(puls flourometry) : که در آن نمونه با یک پالس مختصری از نور درخشان شده و شدت گسیل فلورسانس به شکل تابعی از زمان به وسیله یک سیستم تشخیصی سریع (fast detector system) اندازه گیری میشود. 2 – فلورومتری فازی (phase flourometry) : که در آن یک منبع تابش پیوسته لیزر نمونه را درخشان میکند و گسیل فلورسانس طی زمان پایش از نظر پالس و فرکانس پایش میشود.

 

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics ,fifth edition,chapter10

 



طیف سنجی جذب اتمی (atomic absorption spectrophotometry)

طیف سنجی جذب اتمی در ازمایشگاه های بالینی به شکلی گسترده در اندازه گیری عنصرهای فی مانند الومینیوم ، کلسیوم ، مس ، سرب ، لیتیوم ، مگنزیوم ، روی ، و دیگر فها بکار میرود.

ادامه مطلب


 

طیف سنجی تابش شعله(flame photometry) و طیف سنجی پلاسمای جفت شده القایی(inductively coupled plasma spectrophotometry)

طیف سنجی تابش شعله بر پایه ویژگی های تابش نور توسط اتم های بسیاری از عناصر فی بنا شده است در هنگامی که به آنها انرژی کافی داده شود مانند آنچه که توسط یک شعله داغ تامین میشود. طول موجی که برای اندازه گیری یک عنصر استفاده میشود بستگی به خطی از طول موج دارد که دارای شدت کافی در فراهم کردن حساسیت لازم و عاری بودن از هر گونه خطهای مداخله گر در و یا نزدیک به طول موج انتخاب شده می باشد. 

ادامه مطلب


نور سنجی بازتابش (reflectance photometry)

در نورسنجی بازتابش ، نور بازتاب یافته منتشر شده اندازه گیری میشود.مخلوط واکنش موجود در یک ظرف با نورهای منتشر شده درخشان میشود و شدت نور بازتاب یافته از ماده رنگزا با شدت نور بازتاب یافته از یک سطح مرجع مقایسه میشود.از آنجایی که شدت نور بازتاب یافته با غلظت انالیت یک ارتباط غیر خطی (nonlinear ) دارد از معادله Kubelka-Munk یا تغییر شکل Clapper – Williams معمولا استفاده میشود تا داده ها را به شکل خطی تبدیل کنند (فصل 19 را ببینید).اجزای الکتریکی – نوری استفاده شده در نورسنجی بازتابش در اساس همان است که در نورسنجی بر پایه جذب بکار رفته است به جز اینکه سیستم طوری طراحی شده است که منبع نور و اشکار ساز نزدیک به هم در یک طرف نمونه قرار گرفته اند درست برخلاف فوتومتری جذب که این دو در دو طرف نمونه و در مقابل هم  واقع شده اند.



مقدمه 

بسیاری از اندازه گیری ها که در ازمایشگاه های بالینی انجام میشود بر مبنای اندازه گیری انرژی تابیده شده ، انرژی عبور کرده ، انرژی جذب شده ، انرژی پراکنده شده یا منعکس شده تحت شرایط کنترل شده صورت میگیرد. در این فصل به اصول چنین اندازه گیری هایی می پردازیم.


ماهیت نور 

تابش های الکترومغناطیس شامل انرژی های تابش شده است که طول موچ آنها از 10 nm  در مورد امواج کیهانی شروع میشود و به 1000 km برای امواج رادیویی میرسد. 

ادامه مطلب


اصول تکنیک های پایه و ایمنی در آزمایشگاه 


برای آنالیز درست کمی و کیفی مایعات بدن و بافتها ، متخصصین آزمایشگاهی باید اصول پایه و تکنیکهای شیمی تحلیلی را درک کنند.عواملی که فرایند های تحلیلی و کاربری ها در آزمایشگاه بالینی را تحت تاثیر قرار میدهد شامل 1- مفهوم حلال و حل شونده 2- واحد اندازه گیری 3- مواد شیمیایی 4- مواد مرجع 5- تکنیک های پایه مانند نمونه برداری و توزیع های حجمی ، سانتریفوژ کردن ، اندازه گیری میزان رادیو اکتیویتی ، گران سنجی ، حرارت سنجی ، محلول بافر ، و پردازش محلول ها و 6- ایمنی 

ادامه مطلب


مقدمه 

بسیاری از تصمیمات پزشکی متکی است بر تستهای آزمایشگاهی. پزشکان اغلب در جستجوی این هستند که 1- کدام تست (ها ) بیشتر اختصاصی هستند 2- و کم هزینه تر هستند 3- و یک مسیر درست و موثری را جهت تشخیص یا عملیات پزشکی فراهم میکنند.بهمین جهت در این جا ما به این مساله می پردازیم که چگونه از اطلاعات تشخیصی بدست آمده توسط یک تست استفاده کنیم و نیز تستهای تشخیصی مختلف را چگونه با یکدیگر مقایسه و ارزیابی کنیم.

ادامه مطلب


مقدمه 

انتخاب متدهای تشخیصی جدید و یا اصلاح شده پدیده ای است که در ازمایشگاههای بالینی معمول است . انتخاب و ارزیابی متد دو گام کلیدی در پایه گذاری یک متد تشخیصی محسوب میشوند . و قبل از اینکه این متد ها مورد مصرف معمول قرار بگیرند می بایست به دقت انتخاب شوند و از نظر عملکردی کاملا بررسی شوند .هنگامی که قرار است یک متد جهت مصرف معمول ازمایشگاههای بالینی عرضه شود شاخص های متعددی باید مورد ارزیابی قرار گیرند 

ادامه مطلب


فلورومتری (Fluorometry)

 

فلورسانس به وضعیتی گفته میشود که یک مولکول نور را در یک طول موج جذب کرده و در طول موجی بلندتر گسیل میکند.اتم یا مولکولی که فلورسانس میکند فلوروفور (fluorophore) نامیده میشود. فلورومتری به اندازه گیری نور فلوروسنت گسیل شده گفته میشود.آنالیز فلورومتری یک روش تحلیلی کمی است در علوم شیمیایی و زیستی و تکنیکی بسیار حساس و درست است.

ادامه مطلب


 

فلورومتری (Fluorometry)

 

 

 

 

 

فلورسانس به وضعیتی گفته میشود که یک مولکول نور را در یک طول موج جذب کرده و در طول موجی بلندتر گسیل میکند.اتم یا مولکولی که فلورسانس میکند فلوروفور (fluorophore) نامیده میشود. فلورومتری به اندازه گیری نور فلوروسنت گسیل شده گفته میشود.آنالیز فلورومتری یک روش تحلیلی کمی است در علوم شیمیایی و زیستی و تکنیکی بسیار حساس و درست است.

ادامه مطلب


نفلومتری(nephelometry) و توربیدیمتری(turbidimetry)

پراکنش نور یک پدیده فیزیکی است که از برهم کنش نور با ذرات درون محلول ایجاد میشود.نفلومتری و توربیدیمتری روشهای آنالایتیکالی هستند که برای اندازه گیری نور پراکنده شده بکار برده میشوند.اندازه گیری پراکنش نور در ایمونواسی شماری از پروتیین ها و هاپتن هایی ویژه بکار رفته است.

ادامه مطلب


کمی لومینسانس (chemiluminescence) ، بیولومینسانس (bioluminescence) ، و الکتروکمی لومینسانس (electrochemiluminescence)

کمی لومینسانس ، بیولومینسانس و الکتروکمی لومینسانس گونه هایی از لومینسانس به شمار میروند در که در آنها پدیده تحریک به وسیله 1) واکنش شیمیایی 2) واکنش بیوشیمیایی یا 3) واکنش الکتروشیمیایی ایجاد میشود و نه به وسیله درخشش نوری (photoillumination).

 

مفهوم های پایه

پدیده فیزیکی گسیل نور در کمی لومینسانس ،بیولومینسانس و الکتروکمی لومینسانس همانند فلورسانس است و گسیل نور در آنها از یک تراز یگانه تحریک شده رخ میدهد و هنگامی که الکترون به تراز پایه خود باز میگردد نور گسیل می یابد.

ادامه مطلب


 

فسفرسانس (phosphorescence)

فسفرسانس، لومینسانسی است که شماری از مواد مانند سولفید روی (zinc sulfide) پس از جذب انرژی تابشی یا دیگر انرژی ها تولید میکنند.تفاوت فسفرسانس و فلورسانس در این است که گسیل نور در فسفرسانس از بازگشت حالت الکترونیکی سه گانه تحریک شده مولکول به حالت پایه تولید میشود در برابر گسیل نور از حالت یگانه تحریک شده به حالت پایه در فلورسانس.زمان زوال (decay time) گسیل نور فسفرسانس معمولا بیشتر (10^-4  -  10^2 s) زمان زوال گسیل فلورسانس است و این بخاطر طول عمر بیشتر مولکول ها در حالت سه گانه تحریک شده در فسفرسانس است.فسفرسانس یک سوگرایی بیشتری در طول موج گسیل شده در برابر فلورسانس نشان میدهد.

 


 

فلورومتری (Fluorometry)

 

فلورسانس به وضعیتی گفته میشود که یک مولکول نور را در یک طول موج جذب کرده و در طول موجی بلندتر گسیل میکند.اتم یا مولکولی که فلورسانس میکند فلوروفور (fluorophore) نامیده میشود. فلورومتری به اندازه گیری نور فلوروسنت گسیل شده گفته میشود.آنالیز فلورومتری یک روش تحلیلی کمی است در علوم شیمیایی و زیستی و تکنیکی بسیار حساس و درست است.

ادامه مطلب


 

طیف سنجی جذب اتمی (atomic absorption spectrophotometry)

طیف سنجی جذب اتمی در ازمایشگاه های بالینی به شکلی گسترده در اندازه گیری عنصرهای فی مانند الومینیوم ، کلسیوم ، مس ، سرب ، لیتیوم ، مگنزیوم ، روی ، و دیگر فها بکار میرود.

 

ادامه مطلب


 

طیف سنجی تابش شعله(flame photometry) و طیف سنجی پلاسمای جفت شده القایی(inductively coupled plasma spectrophotometry)

 

طیف سنجی تابش شعله (فلیم فتومتری) بر پایه ویژگی های تابش نور توسط اتم های بسیاری از عناصر فی بنا شده است در هنگامی که به آنها انرژی کافی داده شود مانند آنچه که توسط یک شعله داغ تامین میشود. طول موجی که برای اندازه گیری یک عنصر استفاده میشود بستگی به خطی از طول موج دارد که دارای شدت کافی در فراهم کردن حساسیت لازم و عاری بودن از هر گونه خطهای مداخله گر در و یا نزدیک به طول موج انتخاب شده می باشد. 

ادامه مطلب


 

نور سنجی بازتابش (reflectance photometry)

 

 

در نورسنجی بازتابش ، نور بازتاب یافته منتشر شده اندازه گیری میشود.مخلوط واکنش موجود در یک ظرف با نورهای منتشر شده درخشان میشود و شدت نور بازتاب یافته از ماده رنگزا با شدت نور بازتاب یافته از یک سطح مرجع مقایسه میشود.از آنجایی که شدت نور بازتاب یافته با غلظت انالیت یک ارتباط غیر خطی (nonlinear ) دارد از معادله Kubelka-Munk یا تغییر شکل Clapper – Williams معمولا استفاده میشود تا داده ها را به شکل خطی تبدیل کنند (فصل 19 را ببینید).اجزای الکتریکی – نوری استفاده شده در نورسنجی بازتابش در اساس همان است که در نورسنجی بر پایه جذب بکار رفته است به جز اینکه سیستم طوری طراحی شده است که منبع نور و اشکار ساز نزدیک به هم در یک طرف نمونه قرار گرفته اند درست برخلاف فوتومتری جذب که این دو در دو طرف نمونه و در مقابل هم  واقع شده اند.

 

 

 


طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش سوم

 

 

کالیبراسیون طول موج (wavelength calibration)

در دستگاه های با پهنای باند طیفی باریک ، یک شیشه ای از جنس هولمیوم اکساید (holmium oxide) در طیف 280 nm تا  650 nm اسکن میشود . این ماده قله های جذبی بسیار نوک تیزی در طول موجهایی معین از خود نشان میدهد و کاربر دستگاه میتواند طول موجهایی را که بیشترین جذب را تولید میکنند با مقدار های مشخص شده برای شیشه هولمیوم اکساید مقایسه کند.

ادامه مطلب


طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش دوم

 

منبع های نور (light sources)

انواع منبع های نور که در طیف سنج ها استفاده میشود شامل لامپهای گدازشی (incandescent lamps) ، لامپهای تخلیه زنون (xenon discharge lamps) ، دیودهای تابنده نور (light emitting diods) ، و لیزر ها (lasers) می باشد.

 

لامپهای گدازشی (incandescent) ، جرقه ای (Arc) و کاتدی (cathode)

در این نوع منبع های نور برای اندازه گیری در بخش نور مریی یک طیف ، معمولا از نور تنگستن (tungsten) استفاده میشود.طول عمر رشته تنگستن در حضور فشار کمی از بخارهای ید یا برم در درون لامپ افزایش می یابد( در حدود 2000 تا 5000 ساعت ).

منبع نور تنگستن انرژی تابشی کافی برای اندازه گیری در محدوده فرابنفش (کمتر از 320 nm ) را نمی تواند تامین کند.

ادامه مطلب


طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش اول

 

اسپکتروفتومتری (spectrophotometry) 

فوتومتری به عنوان اندازه گیری نور تعریف میشود و اسپکتروفوتومتری به عنوان اندازه گیری شدت نور در طول موجهای انتخابی تعریف میشود.انالیزهای اسپکتروفوتومتری بصورتهای کمی و کیفی بطور وسیع در علوم زیستی و شیمیایی استفاده میشود ، این متد وابسته به ویژگی های جذب نوری ماده یا مشتقات ماده مورد انالیز دارد.شدت نور عبوری که از یک محلول حاوی یک ماده جذب کننده نور ( رنگزا = chromogen) عبور میکند با کم شدن بخش جذب شده ، کاهش می یابد. این کسر در شدت نور ، تشخیص داده شده ، اندازه گیری شده و برای ارتباط دادن نور عبوری یا جذب شده با غلظت انالیت مورد نظر ارتباط داده میشود .

ادامه مطلب


مقدمه 

بسیاری از اندازه گیری ها که در ازمایشگاه های بالینی انجام میشود بر مبنای اندازه گیری انرژی تابیده شده ، انرژی عبور کرده ، انرژی جذب شده ، انرژی پراکنده شده یا منعکس شده تحت شرایط کنترل شده صورت میگیرد. در این فصل به اصول چنین اندازه گیری هایی می پردازیم.

 

ماهیت نور 

تابش های الکترومغناطیس شامل انرژی های تابش شده است که طول موچ آنها از 10 nm  در مورد امواج کیهانی شروع میشود و به 1000 km برای امواج رادیویی میرسد. با این حال ما در این فصل وقتی در مورد واژه نور صحبت میکنیم شامل انرژی های تابیده شده در گستره فرابنفش تا نور مرئی(180 – 800 nm) است.

ادامه مطلب


الکتروفورز (electrophoresis) - بخش دوم

 

 

ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز (isoelectric focusing electrophoresis)

ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز ترکیبهای امفوتریک (amphoteric) مانند پروتیین ها را با توان جداسازی بالا در یک محیطی با شیب pH پایدار ، جدا میکند.پروتیین تا نقطه ای روی ژل مهاجرت میکند و در آن نقطه متمرکز (focused) میشود که pH ژل در آن نقطه با نقطه ایزوالکتریک (pH ی که بارهای مثبت با بارهای منفی روی مولکول باهم برابرند) پروتیین برابر است.در این نقطه بار پروتیین صفر است و مهاجرت آن متوقف میشود. شکل 12-4 روش انجام و شرایط الکتروفورزی را پیش و پس از برقراری جریان نشان میدهد.

 

بخاطر اینکه ناحیه مربوط به pH مورد نظر بسیار باریک (narrow) است ناحیه های پروتیین ،بسیار شفاف (sharp) هستند. با انتشار معمولی (ordinary diffusion) نیز به وسیله باردار شدن مولکول پروتیین مقابله میشود، همینکه پروتیین از نقطه ایزوالکتریک خود حرکت میکند دارای بار شده و دوباره به وسیله نیروهای الکتروفورزی به نقطه ایزوالکتریک خود باز میگردد( شکل 12-5( .پروتیین هایی که در نقطه ایزوالکتریک خود تنها به اندازه 0.02 واحد pH فرق دارند با ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز جدا شده اند.

شیب pH با امفولیت های حامل (carrier ampholytes) ، گروهی از پلی امینو کربوکسیلیک اسیدهای امفوتریک (polyaminocarboxylic acids  amphoteric) ساخته میشوند که تفاوت بسیار کمی در ارزش pKa خود دارند و وزن مولکولی آنها بین 300 تا 1000 است.مخلوطی از 50 تا 100 ترکیب مختلف به محیط اضافه میشود و یک شیب pH طبیعی به هنگام رسیدن هر امفولیت به نقطه ایزوالکتریک خود طی الکتروفورز ، ایجاد میشود.این ها ناحیه های بافری بسیار باریک و بسیار پایدار ولی با تفاوت بسیار کم در pH ، ایجاد میکنند که از میان آنها پروتیین ها به آهستگی مهاجرت کرده و در نقطه ایزوالکتریک خودشان می ایستند.

همانطور که شکل 12-4 نشان میدهد آند با یک محلول اسیدی رقیق و کاتد با یک محلول قلیایی رقیق در بر گرفته شده است. بعد از تمرکز (focusing) ،امفولیت های حامل و پروتیین های بیشتر منفی در انتهای آند و آنهایی که بیشتر بار مثبت دارند نزدیک انتهای کاتدی ماتریکس الکتروفورزی یافت میشوند.دیگر امفولیت های حامل و پروتیین ها در نقطه های میانه مطابق با نقطه ایزوالکتریک خودشان تمرکز می یابند.از آنجایی که امفولیتهای حامل بطور کلی در غلظتهای بسیار بالا استفاده میشوند یک منبع تغذیه ولتاژ بالا (تا 2000 V) لازم است ( توان نزدیک به 2-50 W است ، بسته به شرایط آزمایش ). در نتیجه ماتریکس الکتروفورزی باید سرد شود. نوع اصلاح شده این تکنیک به نام (IPG-IEF) که در آن شیب pH بی حرکت شده (immobilized pH gradient = IPG) پیش از اینکه نمونه بکار برده شود ایجاد میشود. گزارش شده که این تکنیک اصلاح شده توان جداسازی و بازتولید (reproduceability) را بهبود بخشیده است.

PAGE-IEF به این خاطر که فاقد پدیده الکترواندوسموز است در کارهای انالیزی بسیار استفاده شده است.ژل پلی اکریلامید باید دارای روزنه هایی به اندازه کافی بزرگ باشد اما با این حال از مهاجرت پروتیین ها در اثر غربال مولکولی نباید جلوگیری شود. در عمل از مهاجرت نکردن شماری از پروتیین ها مانند IgM نمیتوان دور بود.AGE-IEF برتری هایی دارد از آنجمله اینکه شرایط آزمایش ساده است و اینکه بزرگی اندازه روزنه ها جدانشدن پروتیین ها بر پایه اندازه مولکولی را نامحتمل میکند.ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز در جداسازی ایزوانزیم های الکالین فسفاتاز و در برنامه های غربالگری نوزادان جهت بررسی واریانت های هموگلوبین بطور گسترده بکار رفته است. تکنیکهای off-gel در محلول آزاد و با نمونه دارای امفولیت ها انجام میشود ، این نمونه در هر یک از سری چاهک (well) های خطی که با غشاهای نیمه تراوا (semipermeable) از هم جدا شده اند و در تماس با یک نوار شیب pH هستند ، بارگذاری میشوند و سپس الکتروفورز انجام میشود. الکتروفورز پروتیین های نمونه را در چاهکهای مختلف بسته به ارزش نقطه ایزوالکتریک آنها جدا میکند. بخش های جدا شده در گام فوینگ دوم مشابه بیشتر جدا میشود و یا اینکه مستقیم ، برای جداسازی بیشتر به روش الکتروفورز دو بعدی (2D electrophoresis) یا روش کروماتوگرافی مایع-اسپکترومتری جرمی (liquid chromatography-mass spectrometry = LC-MS/MS) برداشت میشوند.این تکنیک در بررسی پروتئوم (proteome) انسان کاربرد دارد.

 

 

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12


الکتروفورز (electrophoresis) - بخش دوم

 

 

ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز (isoelectric focusing electrophoresis)

ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز ترکیبهای امفوتریک (amphoteric) مانند پروتیین ها را با توان جداسازی بالا در یک محیطی با شیب pH پایدار ، جدا میکند.پروتیین تا نقطه ای روی ژل مهاجرت میکند و در آن نقطه متمرکز (focused) میشود که pH ژل در آن نقطه با نقطه ایزوالکتریک (pH ی که بارهای مثبت با بارهای منفی روی مولکول باهم برابرند) پروتیین برابر است.در این نقطه بار پروتیین صفر است و مهاجرت آن متوقف میشود. شکل 12-4 روش انجام و شرایط الکتروفورزی را پیش و پس از برقراری جریان نشان میدهد.

 

بخاطر اینکه ناحیه مربوط به pH مورد نظر بسیار باریک (narrow) است ناحیه های پروتیین ،بسیار شفاف (sharp) هستند. با انتشار معمولی (ordinary diffusion) نیز به وسیله باردار شدن مولکول پروتیین مقابله میشود، همینکه پروتیین از نقطه ایزوالکتریک خود حرکت میکند دارای بار شده و دوباره به وسیله نیروهای الکتروفورزی به نقطه ایزوالکتریک خود باز میگردد( شکل 12-5( .پروتیین هایی که در نقطه ایزوالکتریک خود تنها به اندازه 0.02 واحد pH فرق دارند با ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز جدا شده اند.

شیب pH با امفولیت های حامل (carrier ampholytes) ، گروهی از پلی امینو کربوکسیلیک اسیدهای امفوتریک (polyaminocarboxylic acids  amphoteric) ساخته میشوند که تفاوت بسیار کمی در ارزش pKa خود دارند و وزن مولکولی آنها بین 300 تا 1000 است.مخلوطی از 50 تا 100 ترکیب مختلف به محیط اضافه میشود و یک شیب pH طبیعی به هنگام رسیدن هر امفولیت به نقطه ایزوالکتریک خود طی الکتروفورز ، ایجاد میشود.این ها ناحیه های بافری بسیار باریک و بسیار پایدار ولی با تفاوت بسیار کم در pH ، ایجاد میکنند که از میان آنها پروتیین ها به آهستگی مهاجرت کرده و در نقطه ایزوالکتریک خودشان می ایستند.

همانطور که شکل 12-4 نشان میدهد آند با یک محلول اسیدی رقیق و کاتد با یک محلول قلیایی رقیق در بر گرفته شده است. بعد از تمرکز (focusing) ،امفولیت های حامل و پروتیین های بیشتر منفی در انتهای آند و آنهایی که بیشتر بار مثبت دارند نزدیک انتهای کاتدی ماتریکس الکتروفورزی یافت میشوند.دیگر امفولیت های حامل و پروتیین ها در نقطه های میانه مطابق با نقطه ایزوالکتریک خودشان تمرکز می یابند.از آنجایی که امفولیتهای حامل بطور کلی در غلظتهای بسیار بالا استفاده میشوند یک منبع تغذیه ولتاژ بالا (تا 2000 V) لازم است ( توان نزدیک به 2-50 W است ، بسته به شرایط آزمایش ). در نتیجه ماتریکس الکتروفورزی باید سرد شود. نوع اصلاح شده این تکنیک به نام (IPG-IEF) که در آن شیب pH بی حرکت شده (immobilized pH gradient = IPG) پیش از اینکه نمونه بکار برده شود ایجاد میشود. گزارش شده که این تکنیک اصلاح شده توان جداسازی و بازتولید (reproduceability) را بهبود بخشیده است.

PAGE-IEF به این خاطر که فاقد پدیده الکترواندوسموز است در کارهای انالیزی بسیار استفاده شده است.ژل پلی اکریلامید باید دارای روزنه هایی به اندازه کافی بزرگ باشد اما با این حال از مهاجرت پروتیین ها در اثر غربال مولکولی نباید جلوگیری شود. در عمل از مهاجرت نکردن شماری از پروتیین ها مانند IgM نمیتوان دور بود.AGE-IEF برتری هایی دارد از آنجمله اینکه شرایط آزمایش ساده است و اینکه بزرگی اندازه روزنه ها جدانشدن پروتیین ها بر پایه اندازه مولکولی را نامحتمل میکند.ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز در جداسازی ایزوانزیم های الکالین فسفاتاز و در برنامه های غربالگری نوزادان جهت بررسی واریانت های هموگلوبین بطور گسترده بکار رفته است. تکنیکهای off-gel در محلول آزاد و با نمونه دارای امفولیت ها انجام میشود ، این نمونه در هر یک از سری چاهک (well) های خطی که با غشاهای نیمه تراوا (semipermeable) از هم جدا شده اند و در تماس با یک نوار شیب pH هستند ، بارگذاری میشوند و سپس الکتروفورز انجام میشود. الکتروفورز پروتیین های نمونه را در چاهکهای مختلف بسته به ارزش نقطه ایزوالکتریک آنها جدا میکند. بخش های جدا شده در گام فوینگ دوم مشابه بیشتر جدا میشود و یا اینکه مستقیم ، برای جداسازی بیشتر به روش الکتروفورز دو بعدی (2D electrophoresis) یا روش کروماتوگرافی مایع-اسپکترومتری جرمی (liquid chromatography-mass spectrometry = LC-MS/MS) برداشت میشوند.این تکنیک در بررسی پروتئوم (proteome) انسان کاربرد دارد.

 

 

 

 

ایزوتاکوفورز (isotachophoresis)

ایزوتاکوفورز همه مواد یونی کوچکتر را در ناحیه هایی نزدیک به هم بدون همپوشانی ،همه آنهایی را که با سرعت یکسان حرکت میکنند ، جدا میکند.در این تکنیک الکترولیتهای پس زمینه (buffer) با نمونه مخلوط نمی شود و بنابراین همه جریان با یونهای باردار نمونه انجام میشود.بخش کوچکی از نمونه در یک کاپیلاری میان یک محلول الکترولیت پیشرو (leading) که دارای یون های با سرعت مهاجرت بالا نسبت به هر چیزی درون نمونه است و یک محلول دنباله (trailing) که دارای یون هایی با سرعت مهاجرت پایین تر نسبت به آنچه در نمونه است ، جاگذاری میشود.هنگامی که اجزای دارای سرعت بالا بطور کامل از اجزا با سرعت پایین جدا میشود یک ناحیه تهی از بار ایجاد میشود و مقاومت را افزایش میدهد و در نتیجه ولتاژ در آن ناحیه نیز بالا میرود.ولتاژ افزایش یافته سبب میشود که اجزای با سرعت آهسته سریعتر مهاجرت کنند و شکاف به وجود آمده را بپوشانند ، به این وسیله سبب غلیظ شدن آن و افزایش هدایت در ناحیه آن میشود تا اینکه به ناحیه یون های سریعتر برسد. در نهایت ، همه یون ها با سرعت سریعترین یون به سمت ناحیه (zone)هایی مهاجرت میکنند که این ناحیه (zone)ها متناسب با غلظت ابتدایی خود در اندازه فرق دارند.اندازه ناحیه به وسیله اندازه گیری جذب فرابنفش ، اختلاف دما یا هدایت طی گذر نمونه از یک آشکارساز تعیین میشود.کاربردهای این تکنیک در جداسازی همه آنیون ها و کاتیون ها ، اسیدهای آلی و اسیدهای امینه و پپتیدها ، نوکلئوتیدها ،نوکلئوزیدها و پروتیین ها کاربرد دارد.

 

الکتروفورز با میدان پالسی (pulsed-field electrophoresis)

در الکتروفورز با میدان پالسی ، توان (power) بطور دوره ای (alternately) برای جفت الکترودهای مختلف یا ردیفهای الکترودی مختلف بکار برده میشود و بنابراین میدان الکتروفورزی بین دو جهت می چرخد.جهت ها از نظر فضایی از 105 تا 180 درجه می توانند فرق کنند و مولکولها باید خودشان را با جهت میدان جدید ، پیش از اینکه به مهاجرت ادامه دهند در هر دوره (cycle) هم جهت کنند. از آنجایی که زمان جهت گیری دوباره (reorientation) بستگی به وزن مولکولی دارد ، بنابراین مهاجرت خالص (net migration) تابعی از فرکانس تغییر میدان خواهد بود.این تکنیک اجازه جداسازی مولکولهای بسیار بزرگ مانند قطعه های DNA که بزرگتر از 50 kb هستند و نمی توان آنها را با ژل های اگاروز یا پلی اکریلامید دارای روزنه های کوچک جدا کرد، میدهد. قطعه های 50 – 400 kb را میتوان با زمان پالس 10-s جدا کرد در حالی که قطعه های بزرگتر تا 7 مگا باز (7 mb) و یا حتی کروموزوم دست نخورده نیازمند زمان پالس چند ساعتی برای جداسازی کامل میباشند. این تکنیک برای تعیین نوع گونه های مختلف DNA باکتری ها در بررسی های تحقیقاتی و همه گیر شناسی بکار رفته است.

 

الکتروفورز دو بعدی (tow-dimensional(2D) electrophoresis)

 

 

 

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12


الکتروفورز (electrophoresis) - بخش دوم

 

 

ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز (isoelectric focusing electrophoresis)

ایزوالکتریک فوینگ الکتروفورز ترکیبهای امفوتریک (amphoteric) مانند پروتیین ها را با توان جداسازی بالا در یک محیطی با شیب pH پایدار ، جدا میکند.

ادامه مطلب


الکتروفورز (electrophoresis) - بخش سوم

 

 

میکروچیپ الکتروفورز (microchip electrophoresis)

طی یک دهه گذشته میکروچیپ الکتروفورز تحول های بنیادینی را به خود دیده است در 1) طراحی های میکروچیپ مجتمع  2) سیستم های آشکار ساز پیش رفته  3) کابردهای جدید. در حوزه تشخیص بالینی ،آنالیتهای عمده مورد جستجو در قالب میکروچیپ پروتیین ها و DNA هستند.

از میان ویژگی های جداسازی با میکروچیپ الکتروفورز میتوان به سرعت بالای آن – به طور طبعی چهار تا ده برابر سریعتر از الکتروفورز مویین معمولی است و حداقل چندین برابر سریعتر از روشهای ژل های ورقه ای (slab gel) است.دیگر برتری های میکروچیپ الکتروفورز شامل 1) سادگی  2) توانایی در مجتمع کردن میکروچیپ ها با چندین عملکرد و  3) توانایی در خودکار شدن آن است.

 

دستگاهی کردن (instrumentation)

اگرچه در اصول شبیه به همتای الکتروفورز مویین خود است اما از نظر دستگاهی سیستم میکروچیپ از آن متفاوت است.برای نمونه در روش میکروچیپ 1) کانالهای جداسازی  2) کانالهای تزریق نمونه  3) مخزن ها  4) آماده سازی نمونه  و یا 5) ری اکتورهای های پیش یا پس از ستون (precolumn or postcolumn reactors) همه روی یک سطح میکروچیپ با بکارگرفتن فرایندهای فوتولیتوگرافیک ساخته میشوند.طرح T متقاطع (cross-T design) کلاسیک از یک میکروچیپ تک کانال شامل یک کانال (تزریق) کوتاه است که کانال (جداسازی) بلندتر را را قطع میکند و شامل یک مخزن در انتهای هر یک از آنها است که در شکل 12-9 نشان داده شده است.ساختار آشکارسازی بر پایه فلورسانس القایی با لیزر (laser-induced fluorescence=LIF) در یک میکروچیپ تک کانال در شکل 12-10 نشان داده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12


الکتروفورز (electrophoresis) - بخش سوم

 

 

میکروچیپ الکتروفورز (microchip electrophoresis)

طی یک دهه گذشته میکروچیپ الکتروفورز تحول های بنیادینی را به خود دیده است در 1) طراحی های میکروچیپ مجتمع  2) سیستم های آشکار ساز پیش رفته  3) کابردهای جدید. در حوزه تشخیص بالینی ،آنالیتهای عمده مورد جستجو در قالب میکروچیپ پروتیین ها و DNA هستند.

از میان ویژگی های جداسازی با میکروچیپ الکتروفورز میتوان به سرعت بالای آن – به طور طبعی چهار تا ده برابر سریعتر از الکتروفورز مویین معمولی است و حداقل چندین برابر سریعتر از روشهای ژل های ورقه ای (slab gel) است.دیگر برتری های میکروچیپ الکتروفورز شامل 1) سادگی  2) توانایی در مجتمع کردن میکروچیپ ها با چندین عملکرد و  3) توانایی در خودکار شدن آن است.

 

دستگاهی کردن (instrumentation)

اگرچه در اصول شبیه به همتای الکتروفورز مویین خود است اما از نظر دستگاهی سیستم میکروچیپ از آن متفاوت است.برای نمونه در روش میکروچیپ 1) کانالهای جداسازی  2) کانالهای تزریق نمونه  3) مخزن ها  4) آماده سازی نمونه  و یا 5) ری اکتورهای های پیش یا پس از ستون (precolumn or postcolumn reactors) همه روی یک سطح میکروچیپ با بکارگرفتن فرایندهای فوتولیتوگرافیک ساخته میشوند.طرح T متقاطع (cross-T design) کلاسیک از یک میکروچیپ تک کانال شامل یک کانال (تزریق) کوتاه است که کانال (جداسازی) بلندتر را را قطع میکند و شامل یک مخزن در انتهای هر یک از آنها است که در شکل 12-9 نشان داده شده است.ساختار آشکارسازی بر پایه فلورسانس القایی با لیزر (laser-induced fluorescence=LIF) در یک میکروچیپ تک کانال در شکل 12-10 نشان داده شده است.

 

 

 

هنگامی که حجم مورد نیاز برای پر کردن ساختار میکروچیپ مقایسه میشود ، درمیابیم که حجم کانال جداسازی روی میکروچیپ چندین برابر کوچکتر (جند نانولیتر) از سیستمهای الکتروفورز مویین معمولی است.با این نیازهای حجمی گفته شده (نانولیتر و حتی در بازه پیکولیتر) تزریق با فشار بسیار چالش زا است ( اما ناممکن نیست) و تزریق نمونه به روش الکتروکینتیک روش اصلی است.در عمل یک ولتاژ تزریق چندین صد ولتی بر نمونه و مخزنهای ضایعات نمونه بکار برده میشود تا نمونه را به تقاطع تزریق ببرد که این تزریق معادل حجمی از 50 تا 100 پیکولیتر است.یک ولتاژ جداسازی (1-4 kV) در کانال جداسازی بکار برده میشود .چنین ولتاژی سبب جداسازی زون های انالیت میشود پیش از اینکه به پنجره آشکارسازی (detection window) در پایین دست کانال جداسازی برسند.شایان ذکر است اگر چه حجم نمونه تزریق شده 100-500 pL است اما حجم نمونه واقعی مورد نیاز 2-4 uL است بسته به اندازه مخزن.

آشکارسازی در میکروچیپ بطور عمده با LIF انجام میشود چون این نوع آشکارسازی با پیکربندی مسطح میکروچیپ سازگار است (شکل 12-10 را ببینید).حد تشخیص برای فلوئور های فلورسئین مانند ثابت شده که به اندازه 10^-11 mol و حتی به اندازه 10^-13 mol بوده است ،جرم تشخیصی برابر با چند صد مولکول.زمان جداسازی میکروچیپ های معمولی از 50 تا 200 ثانیه است.

 

تشخیص مولکولی با میکروچیپ ها (molecular diagnostics using microchips)

بدلیل آسان بودن روش که در آن DNA دو رشته ای ، به وسیله درج شونده (intercalator) های فلورسنت DNA دو رشته ای دارای میل ترکیبی بالا (high affinity dsDNA fluorescent intercalators) ، فلورسانس نشان میدهند و حساسیت تشخیصی بسیار عالی که از LIF بدست میاید، جداسازی DNA در میکروچیپ ها بسیار سریعتر از جداسازی پروتیین ها پیش رفته است.

در نهایت اینکه الکتروفورزهای نوع لوله مویین و میکروچیپ به عنوان یک گزینه با هم یکی شده اند تا جایگزین الکتروفورز از نوع slab gel سنتی ، در آنالیز DNA باشند.

 

 

 

 

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12


الکتروفورز (electrophoresis) - بخش سوم

 

 

میکروچیپ الکتروفورز (microchip electrophoresis)

طی یک دهه گذشته میکروچیپ الکتروفورز تحول های بنیادینی را به خود دیده است در 1) طراحی های میکروچیپ مجتمع  2) سیستم های آشکار ساز پیش رفته  3) کابردهای جدید. در حوزه تشخیص بالینی ،آنالیتهای عمده مورد جستجو در قالب میکروچیپ پروتیین ها و DNA هستند.

ادامه مطلب


کروماتوگرافی و استخراج (chromatography and extraction)

 

مایع های زیستی مخلوط های پیچیده ای هستند و آزمایشهای بالینی برای اجزای خاصی از این مایع ها اغلب یک یا چند مرحله جداسازی پی در پی را می خواهد تا اجزای مورد نظر جدا یا تغلیظ شوند.روشهای معمول برای دست یافتن برای این جداسازی شامل 1) کروماتوگرافی (chromatography) 2) استخراج (extraction) 3) پرسیپیتاسیون افتراقی (differential precipitation) 4) الکتروفورز (electrophoresis) .این فصل مفاهیم پایه و اصول کروماتوگرافی و استخراج را که به عنوان تکنیکهای آنالیتیکال بکار میروند را توصیف میکند.

 

کروماتوگرافی (chromatography)

کروماتوگرافی فرایندی است که در آن اجزای یک مخلوط به وسیله توزیع افتراقی (differential distribution) میان فاز متحرک (mobile phase)  و فاز ثابت (stationary phase)، جدا میشوند.

ادامه مطلب


آخرین مطالب

آخرین ارسال ها

آخرین جستجو ها